海南大学Jingrong Ma课题组为了更好地了解椰子球蛋白（CG）在不同pH下的乳化机制，研究了不同pH（3-11）未加热和加热（90℃，30 min）条件下的界面行为与乳液稳定性（O/W）之间的关系。CG的动态界面张力在pH为11时最低，其次是pH为9、3、7和5。CG在pH值为5时界面吸附效果最好，但在pH值为11时界面出现解吸情况。各组在加热后吸附量均下降。pH为5时的CG具有最高的扩张弹性模量（Ed），其次是pH为3、7、9和11。加热CG的Ed趋势与未加热样品一致，但明显降低。在高频和振幅扰动下，pH为11处的CG具有较高的膨胀模量(E)。CG表现出更好的界面行为，有助于提高pH 3时的乳液稳定性。阐明界面行为与乳化液稳定性的关系对促进CG作为乳化剂的应用具有重要意义。

动态界面张力测量方法

一、实验前准备

1.仪器与试剂

仪器：Kibron界面张力仪（含Wilhelmy板或Du Noüy环、恒温水浴?？椤⒆远鳎?、pH计（精度±0.01）、电子天平（称量蛋白）、磁力搅拌器、离心机（可?。?、移液枪（1-1000μL）、烧杯/样品池（洁净无污染）。

试剂：椰子球蛋白（纯度≥90%，建议分子量10-50 kDa）、超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）、缓冲溶液（如PBS缓冲液，pH范围5.0-9.0，离子强度0.01-0.1 M，避免干扰蛋白质吸附）、稀盐酸/氢氧化钠（调节pH）。

二、操作步骤

步骤1：仪器预热与校准

开机：连接电源，打开Kibron界面张力仪主机及软件（如DeltaFlow或Kibron Control），启动恒温水浴?？椋ㄉ柚媚勘晡露?，通常25±0.1℃，界面张力受温度影响显著）。

校准：

Wilhelmy板法：使用标准液体（如超纯水，25℃时γ≈72 mN/m）校准。将洁净的Wilhelmy板（铂片，尺寸约10×20 mm，边缘垂直）安装到传感器上，确保板面无划痕、无油脂（可用乙醇擦拭后灼烧冷却）。在软件中输入标准液体的表面张力值，仪器自动校准位移传感器与力的关系。

Du Noüy环法（若使用）：校准环的周长（需测量环的内外径，计算平均周长），并用已知表面张力的液体验证准确性。

步骤2：椰子球蛋白样品制备

溶解：称取一定量椰子球蛋白（如10 mg），加入5-10 mL对应pH的缓冲液（如pH 7.0的PBS），磁力搅拌（300 rpm）或漩涡振荡15-30 min，至完全溶解（避免剧烈搅拌产生气泡）。

pH调节：用1 M HCl或NaOH溶液逐滴调节蛋白溶液pH至目标值（如pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），每次调节后静置2 min，用校准过的pH计测量确认（插入深度≥1 cm，避免界面干扰）。

脱气（可?。喝羧芤汉芙馄澹ㄈ缈掌?，可将样品置于真空干燥器中10-15 min，减少界面气泡（气泡会导致界面张力测量值偏高）。

步骤3：界面张力测量

安装样品池：将清洁的样品池（玻璃或聚四氟乙烯材质，内径≥50 mm）置于仪器样品台上，用移液枪注入20-30 mL待测蛋白溶液（液面高度需覆盖Wilhelmy板浸入深度，通?！?0 mm）。

安装Wilhelmy板：手动或自动将Wilhelmy板缓慢浸入样品池，确保板面与液面垂直，且边缘刚好接触液面（软件提示“板接触液面”后停止）。

平衡等待：启动测量程序，仪器自动记录界面张力随时间的变化。蛋白质需在界面上吸附达到平衡（通常5-30 min，具体时间需预实验确定，观察数据趋于稳定后停止）。

数据采集：平衡后，软件自动记录稳定的界面张力值（γ），每个pH条件重复测量3次（更换新鲜样品），取平均值。

步骤4：清洗与切换样品

测量完一个pH样品后，用去离子水或下一个pH缓冲液冲洗样品池和Wilhelmy板3次（避免交叉污染）。

若板面有残留蛋白，可用软毛刷轻刷铂片（避免刮伤），再用乙醇擦拭后灼烧（仅适用于耐高温铂片）。

三、注意事项

1.pH调节的关键控制

蛋白质的界面张力对pH敏感（尤其接近等电点pI时，电荷减少，疏水性增强），需精确调节pH（建议使用微量移液枪逐滴添加，并充分混匀）。

避免pH调节剂过量（如HCl/NaOH浓度过高可能破坏蛋白质构象），推荐使用0.1 M缓冲液储备液稀释至目标离子强度（如0.01 M）。

2.蛋白质溶液的稳定性

椰子球蛋白在极端pH（如pH＜5或＞9）可能变性沉淀，需通过预实验确定其稳定pH范围（通常接近生理pH 5-7）。若出现沉淀，需离心（10,000×g，10 min）去除，取上清测量（沉淀可能干扰界面吸附）。

蛋白质浓度需适宜（建议0.1-1 mg/mL）：浓度过低时界面吸附量不足，界面张力偏高；过高可能导致界面膜过厚，吸附动力学复杂。

3.仪器清洁与污染防控

Wilhelmy板需保持绝对洁净（任何油脂或灰尘会导致界面张力测量值偏差），使用前可用铬酸洗液浸泡（10%H?CrO?）10 min，再用超纯水冲洗并干燥。

样品池每次使用后需用去离子水冲洗，避免残留盐类或蛋白质吸附（尤其高离子强度缓冲液易在池壁结垢）。

4.温度与界面稳定

界面张力随温度升高显著降低（约每℃下降0.1-0.2 mN/m），需使用恒温水浴严格控制温度（误差±0.1℃），并在测量时等待样品与仪器温度平衡（约5 min）。

避免环境温度波动（如空调风直吹），可在仪器周围放置隔热罩。

5.数据可靠性验证

每次测量前检查Wilhelmy板的湿润性（浸入纯水后应能自动吸附，无气泡附着）。若板面疏水，可用稀表面活性剂（如0.01%SDS）浸泡清洗（仅限玻璃板，铂片禁用）。

预实验验证蛋白质在界面的吸附行为：通过动态界面张力曲线（γ-t）判断是否达到平衡（斜率趋近于0），若长时间不稳定（如持续下降），可能是蛋白质未完全溶解或溶液中有杂质。

结果

Kdiff、Kp和Kr的最高值分别为pH值7、3和5。柔性蛋白可以在油水界面上更快地吸附和重新排列。pH为3时CG灵活的二级结构，使其具有更好的吸附动力学，。pH 5（接近pI 4.3）的CG更弱的静电斥力，引起了更好的结构重排。加热后，除pH值为5时CG的Kdiff外，所有样品的Kdiff、Kp和Kr均有所下降。加热后的CG具有较低的初始界面张力和较短的平衡吸附时间（图1a），它能迅速达到平衡状态，并且吸附动力学指数较低。此外，加热后的CG表现出显著的变性和聚集，残留的蛋白质分子会产生空间位阻，从而阻碍聚集后的CG到达油水界面。此外，不溶性CG聚集体对残留CG分子的吸附产生了屏障。CG在pH为5时，蛋白质形成大量沉淀，溶解度仅为12.05%?？扇苄缘鞍缀康鸵馕蹲沤先醯木驳缗懦饬Γ馐故Ｓ嗟牡鞍赘菀桌┥?，从而导致最高的Kdiff。与动态界面张力相比，CG与pH 5T的吸附动力学不受蛋白质浓度的影响。