研究简介：肺表面活性剂（PS）是一种复杂的脂质/蛋白质混合物，覆盖在肺泡的空气-液体界面上，主要功能是降低表面张力，防止肺泡在呼气末塌陷。PS的生物物理功能依赖于其独特的成分，其中主要成分是二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DPPC），还包含其他磷脂、胆固醇以及特定的蛋白质，特别是疏水蛋白SP-B和SP-C。SP-B和SP-C虽然在PS中的总质量占比不到1%，但对PS的生物物理功能至关重要。然而SP-B和SP-C在PS三维结构形成中的具体作用机制尚不清楚。其功能依赖于在肺泡界面形成并维持一个复杂的单层膜及与之相连的亚表面多层膜（即“储备库”）系统，该3D结构能够在呼吸周期中实现脂质的快速交换与补充。然而这一关键3D结构形成的具体蛋白驱动机制尚不明确。

研究者使用了多种实验技术，包括中子反射（NR）、表面压力-面积（Π-A）等温线、椭偏光测量和表皮荧光显微镜，来研究PS膜和薄膜在不同压缩阶段的结构。实验中使用了由DPPC、棕榈酰油?；?sn-甘油-3-磷酰胆碱（POPC）和棕榈酰油?；?sn-甘油-3-磷脂酰甘油（POPG）组成的模型PS膜，并在其中添加了10%的SP-B或SP-C。研究结果表明，SP-B在PS膜的三维结构形成中起着关键作用，能够稳定界面并促进脂质储库的形成。而SP-C虽然在脂质交换中发挥作用，但需要SP-B的存在才能整合到界面结构中。这些发现为理解PS在呼吸过程中的动态行为提供了重要的结构基础，并为设计新一代优化的临床PS制剂提供了理论依据。

Kibron LB膜分析仪的的应用

Kibron LB膜分析仪用于在受控条件下制备、压缩和分析气-液界面上的肺表面活性物质模型膜，并与其他分析技术联用。实验前，LB槽体需用氯仿和超纯水仔细清洁，然后注入170 mL的Tris-NaCl缓冲液（pH 7.4)。将溶解在氯仿/甲醇（2:1,v/v）中的脂质或脂质/蛋白质混合溶液，使用汉密尔顿微量注射器铺展在空气-水界面上。在开始压缩前，预留15分钟让溶剂完全蒸发。压缩过程的速率控制在8.8 cm2?min?1。亚相温度通过循环水浴维持在22.0±0.1°C。表面压力通过使用滤纸制成的Wilhelmy吊片法压力传感器进行记录。

LB膜分析仪可获取表面压力-面积（Π-A）等温线，直接用于测量模型单层膜（纯脂质、脂质+SP-B、脂质+SP-C）的压缩Π-A等温线。等温线显示，所有系统在压缩至约40 mN/m时均出现一个明显的平台区，这对应于单层膜从二维向三维结构的转变（buckling-dominated collapse），模拟了生理呼气末期的膜重组过程。通过计算平台区压缩面积占总面积的百分比（%Aplateau），研究人员量化了SP-B和SP-C在稳定三维结构能力上的差异。结果表明SP-B系统的%Aplateau（35%）显著高于SP-C系统（27%）和纯脂质系统（18%），直接证明了SP-B在促进和稳定膜储备库形成方面具有更强大的能力。与椭圆偏振测量联用，研究中，将Beaglehole Picometer Light Ellipsometer与Kibron G2槽联用，实时监测压缩过程中光学参数d△的变化。

实验结果

提出的结果清楚地证明了蛋白质SP-B在压缩下成核和稳定3D界面多层储层的关键作用，而SP-C的作用似乎是辅助的——促进脂质交换，但需要SP-B来结构整合到界面结构中。从表面循环前后的中子反射法的可比剖面推断出，这些SP-B促进的储层一旦受到类似呼吸的压缩-膨胀动力学，就会与界面稳定地结合。然后SP-B被证实是维持肺泡空间PS薄膜复杂结构的关键分子。本工作连接了早期的分子模拟和生理学研究，为SP-B独特的界面重塑能力提供了直接的实验证据，这与之前关于SP-B对呼吸和生命至关重要的知识一致。未来结合氘代蛋白、生理脂质混合物和全组合蛋白质补体的工作将完善对PS动力学的理解，对设计新一代优化的临床PS制剂以治疗尚未解决的表面活性剂缺乏性肺部疾病产生影响。

图1、实验方法的示意图总结。A)将肽溶液制备成DMF。B)在空气-水界面处沉积并使用LB装置进行压缩。C)转移到云母基材上。D)用金属盐选择性浸渍并用UV/O3去除肽。

图2、A)FP1和FP2肽的化学结构。FP1（B和D）和FP2（C和E）肽LB膜的AFM显微照片分别在无压缩（B和C）和20 mN m-1（D和E）的情况下转移到新鲜切割的云母基底上。F,G)导致纤维形成的肽β-折叠二级结构的示意图。H)在这项工作中研究的样品的LDIR光谱。I)将酰胺I带解卷积为其主要成分。

图3、A)在空气/水界面上铺展的FP2肽的压缩等温线π–A以及在3、10、20和30 mN m?1下获得的LB肽膜的AFM显微照片（分别为B、C、D和E））。

图4、A)用于拟合NR数据的模型示意图。B)10、C)20和D)30 mN m-1处界面的密度分布。E）通过NR获得的纤维的总厚度。F)界面剪切流变测量。G)通过分析AFM图像获得纤维的间距和曲率。

图5、从35 mN/m处的拟合获得的结构参数分别表示每层的厚度和水体积分数。ΔSLD（%）表示拟合SLD与理论SLD值之间的百分比差。

总结

自发现以来，破译呼吸气液界面处肺表面活性剂（PS）的分子结构一直是一项重大挑战。这在呼气结束时的最小肺容积和表面积下尤为重要，此时PS会迅速重组为3D膜网络而不会与界面膜分离，从而确保后续呼吸周期的准备和稳定性。研究人员利用中子反射法和落射荧光显微镜在专门设计的表面天平中，研究了模型PS膜和薄膜在不同压缩阶段的结构，重点关注疏水表面活性剂蛋白SP-B和SP-C在界面系统组织中的关键作用。所研究的模型表面活性剂薄膜的结构（均与界面平面正交和横向分析）在很大程度上取决于成分。阐明了SP-B和SP-C的不同作用，揭示了只有SP-B（表面活性剂中唯一对生命不可或缺的蛋白质）在界面下方的3D膜库成核。

Kibron LB膜分析仪（及同类型Langmuir槽）在本研究中是不可或缺的基础工具。它不仅是获取膜宏观力学性能（如Π-A等温线）的主要设备，更是一个多功能平台，通过与其他技术（椭圆偏振、NR）联用，实现了对界面膜结构、组成和动态行为的原位、实时、多尺度分析。该设备的精确控压能力，为最终通过中子反射技术直接观察到SP-B特异性的3D储备库结构提供了关键且可靠的实验条件，从而有力地支撑了本研究的核心结论。本研究首次通过中子反射等技术在纳米尺度上直接证实了SP-B是肺表面活性物质在肺泡界面形成和维持3D膜储备库的关键“建筑师”，而SP-C则扮演辅助角色。这一发现从结构生物学的角度深刻揭示了PS维持呼吸力学稳定的分子基础，不仅与SP-B基因缺失致死、而SP-C缺失导致慢性呼吸问题的生理现象相吻合，也为未来开发治疗呼吸窘迫综合征等肺表面活性物质功能障碍疾病的更优仿生制剂提供了关键的理论依据和新的设计思路。