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槐糖脂的属性：脂肪酸底物和混合比例的影响——材料和方法
来源：上海谓载 浏览 1874 次 发布时间:2021-11-17
材料和方法
材料
所有培养基成分均从Sigma-Aldrich化学公司购买，但由Fluka Biochemika（瑞士Buchs）经销的酵母提取物除外，且所有溶剂均为HPLC级，并从Burdick和Jackson（密歇根州Muskegon）处购买。
槐脂合成
在假丝酵母生长培养基（CGM）中制备假丝酵母ATCC 22214接种物，该培养基由以下物质组成（g/l）：葡萄糖，100；酵母抽提物，10；和尿素，1，根据先前公布的方法（Ashby等人，2005年）。在2.5升台式发酵罐（Bioflo III间歇式/连续式生物反应器，新泽西州新不伦瑞克）中，在2升培养基中进行槐脂合成?；維L生产培养基（CGM培养基）由上述相同成分和相同比例组成。用浓盐酸将pH值调至6.0，并通过高压灭菌对CGM培养基进行灭菌。灭菌后，将温度平衡至26℃，并将棕榈酸、硬脂酸、油酸或亚油酸作为脂质共基质以2%（w/v）的比例添加到培养基中，使每个培养基在接种前的最终pH值为5.8±0.2。添加棕榈酸和硬脂酸作为不溶性固体，而添加油酸和亚油酸作为不混溶液体。将50 ml冷冻接种培养物解冻并用于接种每次发酵。生长/生产条件如下：温度=26-C，搅拌（叶轮转速）=700 rpm，空气流量=2 l空气/分钟，无pH控制。2天后，向发酵液中添加额外的5%（w/v）干葡萄糖和2%（w/v）脂肪酸，当添加额外的0.5%（w/v）脂肪酸时，允许发酵持续5天。然后继续发酵2天（发酵的总持续时间为7天）。
槐脂的分离纯化
为了分离SLs，将整个培养物（细胞和肉汤）分成等份，并冻干（*2天）。将干燥的残留物放入1 l锥形烧瓶中，通过在250 rpm、30-C下摇晃2天，用过量的乙酸乙酯提取每部分。在整个提取过程中，定期移除50 ml乙酸乙酯，并通过TLC测试内酯相对于开链形式的优先溶解度的可能性（过程见下文）。提取物通过Whatman 2号滤纸过滤，剩余固体用乙酸乙酯洗涤两次（每次500 ml），以最大限度地提高回收率。通过蒸发浓缩含有SLs的合并乙酸乙酯馏分，并将其添加到1 l己烷中以沉淀纯SLs。通过过滤从己烷中回收纯SLs，并在干燥器中真空干燥以获得细白色粉末，然后精确称量以获得产品产率。
槐脂分析
使用硅胶板（250 lm层厚，17 lm粒径，60 A?孔径（Sigma-Aldrich）和氯仿/甲醇/水（80:20:1，体积比为溶剂）通过薄层色谱法阐明SL在乙酸乙酯中的优先溶解度和分馏。显影剂为乙醇中的5%（w/v）磷钼酸，然后炭化。
如前所述测定SL含量（Nun?ez等人，2001）。简言之，SL混合物通过HPLC使用Waters 2690分离模块（Waters公司）使用15 cm 9 2.1 mm对称C18 3.5 lm柱进行分离。使用线性梯度洗脱法从水/乙腈（0.5%甲酸）/乙腈（50:10:40，体积比）中进行洗脱并在25分钟内将其与乙腈（0.5%甲酸）/乙腈（10:90，体积比）保持5分钟，总运行时间为35分钟。流速为0.25 ml/min。将流出物连接到带有APCI探针的微型质量ZMD质谱仪（水）设置为正模式，每次扫描2秒，从m/z 200扫描到m/z 1000。电晕针电压调整为3.8 kV，样品锥20 V，提取锥2 V，用于检测碎片和分子离子（[m]+）。
表面活性测定
在滴体积Kru–ss DVT30张力计（Kru–ss USA，北卡罗来纳州夏洛特）上测量油水界面张力（IFT）。水相含有200mg表面活性剂/l，0.01M Na2SO4，0.77mm CaCl2，0.26mm MgCl2，pH值8.0。油菜（菜籽）油用作油相。在10微升油/分钟时记录三次测量的平均值。使用Kibron Delta-8张力计（Kibron Inc.，芬兰赫尔辛基）测定临界胶束浓度（CMC）和最小表面张力（min.ST）。样品溶液含有0.01 mNa2SO4、0.77 mM CaCl2、0.26 mM MgCl2和各种浓度的表面活性剂，pH值为8.0。所有物理性质测量均在室温下进行。